LRRC55基因甲基化定量检测方法
本发明属于生物医学技术领域。基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展，本发明的目的在于克服甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法的缺点，提供一种操作简便、敏感性高的LRRC55基因甲基化定量检测方法。本发明取胰腺癌组织，提取DNA制备ACTB的标准曲线样品，利用全甲基化模板，制备LRRC55的标准曲线样品；提取待测组织DNA，并进行化学修饰，针对人LRRC55基因启动子区CPG岛设计甲基化引物及探针，针对人参照基因ACTB启动子区CPG岛设计BSP引物及探针，采用Taqman-MGB实时定量PCR方法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR，计算出LRRC55基因甲基化程度的定量值。本发明方法快速、准确、灵敏度高。
发明专利
CN201010125657.2
2010-03-16
CN101967514A
2011-02-09
C12Q1/68(2006.01)I
中国人民解放军第二军医大学
李兆申;高军;吕顺莉;杜奕奇;龚燕芳;黄浩杰;王小玮
200433 上海市翔殷路800号
上海德昭知识产权代理有限公司 31204
丁振英
上海;31
一种LRRC55基因甲基化定量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：A、待检样本处理：用QIAGEN?EpiTect?Bisufite?KitTM试剂盒对待检样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；B、分别制备ACTB参照基因的标准品和LRRC55靶基因的标准品：设计并合成ACTB参照基因的BSP引物：ACTB?BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT?3′ACTB?BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA?3′设计并合成LRRC55靶基因的MSP引物：LRRC?55BF：5′GGTTTAGAAAAATGAGTTTG′3′LRRC55BR：5′CCTTCATCCCAACATCCCTT?3′ACTB参照基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；LRRC55靶基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.57.75℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；PCR产物进行纯化，连接入pMD18?T?Vector，然后电击法转化至E.coliDH5α、工程菌，测序正确的重组菌进行扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和LRRC55靶基因的标准品；C、在BSP扩增片段内设计MSP引物及探针LRRC?55MF：5’GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC?3’LRRC55MR：5’AAAAAAACCGAAAATAATACCACG??3’D、LRRC55基因甲基化的定量检测：设计并合成ACTB的探针和LRRC55的探针：ACTB探针：FAM?TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG?MGBLRRC55探针：FAM?ATAGTAGGTGGGTAAGGG?MGB对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR、条件是：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环；检测ACTB和LRRC55基因的拷贝数；待检样本DNA中LRRC55基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中LRRC55基因甲基化程度的定量值。