DNA甲基化测定方法

摘要：

本发明涉及对生物来源标本中所含的基因组DNA中的目标DNA区域中甲基化后的DNA的含量对进行测定的方法等。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200980118263.X

申请日期：2009-03-25

公开/公告号：CN102037140A

公开/公告日：2011-04-27

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

申请/专利权人:住友化学株式会社

发明/设计人:冨原祥隆;佐藤日出夫;樽井弘和

主申请人地址:日本国东京都

专利代理机构:中科专利商标代理有限责任公司 11021

代理人:朱丹

国别省市代码:日本;JP

权利要求：

一种对生物来源标本中所含基因组DNA中的DNA区域的甲基化后的DNA的含量进行测定的方法，其特征在于，具有：(1)第一工序，对生物来源标本中所含基因组DNA来源的DNA试样实施利用甲基化敏感性限制酶的消化处理；(2)第二工序，从在第一工序中得到的经过消化处理的DNA试样取得甲基化后的单链DNA，使该单链DNA和固定化甲基化DNA抗体结合而选择单链DNA；及(3)第三工序，其具有前步骤和本步骤，作为下述的各本步骤的前步骤，具有：第一前步骤，将由第二工序选择的单链DNA从固定化甲基化DNA抗体分离而成为单链状态的DNA(正链)；第二前步骤，使用在第一前步骤中成为单链状态的基因组来源的DNA(正链)，并使用下述延伸引物(正向引物)作为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使包含目标DNA区域的单链DNA(正链)延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(正向引物)中有相对于单链状态的DNA(正链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)，该部分碱基序列(正链)与所述目标DNA区域的碱基序列(正链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；和第三前步骤，其中，将在第二前步骤中延伸形成的双链DNA，暂时分离成包含目标DNA区域的单链DNA(正链)和包含相对于目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)，并且，作为本步骤，具有：(a)第A步骤(本步骤)，其以生成的包含目标DNA区域的单链DNA(正链)为模板，将所述正向引物用作延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA；和(b)第B步骤(本步骤)，其以包含相对于已生成的目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)为模板，以下述延伸引物(反向引物)为延伸引物，使该延伸引物延伸一次，由此使所述的包含目标DNA区域的单链DNA延伸形成为双链DNA，所述延伸引物(反向引物)中有相对于包含与所述目标DNA区域具有互补性的碱基序列的单链DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，该部分碱基序列(负链)与相对于所述目标DNA区域的碱基序列(正链)具有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧；进而在将由所述各本步骤得到的经延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态之后反复进行第三工序的各本步骤，由此对所述目标DNA区域中甲基化后的DNA进行扩增直至达到可以检测的量，对被扩增的DNA的量进行定量。