PAPOLB基因甲基化定量检测方法
本发明属于生物医学技术领域。基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展，本发明的目的在于克服甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法的缺点，提供一种操作简便、敏感性高的PAPOLB基因甲基化定量检测方法。本发明取胰腺癌组织，提取DNA制备ACTB的标准曲线样品，利用全甲基化模板，制备PAPOLB的标准曲线样品；提取待测组织DNA，并进行化学修饰，针对人PAPOLB基因启动子区CPG岛设计甲基化引物及探针，针对人参照基因ACTB启动子区CPG岛设计BSP引物及探针，采用Taqman-MGB实时定量PCR方法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR，计算出PAPOLB基因甲基化程度的定量值。本发明方法快速、准确、灵敏度高。
发明专利
CN200910056222.4
2009-08-11
CN101613749
2009-12-30
C12Q1/68(2006.01)I
中国人民解放军第二军医大学
李兆申;黄浩杰;高 军;杜奕奇;龚燕芳
200433上海市翔殷路800号
上海德昭知识产权代理有限公司
丁振英
上海;31
1、一种PAPOLB基因甲基化定量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：A、待检样本处理：用QIAGEN EpiTect Bisufite KitTM试剂盒对待检样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；B、分别制备ACTB参照基因的标准品和PAPOLB靶基因的标准品：设计并合成ACTB参照基因的BSP引物：ACTB BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′ACTB BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′设计并合成PAPOLB靶基因的MSP引物：PAPOLB MF：5′GCGTTGAAAGATGATGTCGTTTTC 3′PAPOLB MR：5′ATAAACGAAAAAACGCCGTAACG 3′ACTB参照基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；PAPOLB靶基因进行MSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.61℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；PCR产物进行纯化，连接入pMD18-T Vector，然后电击法转化至E.coliDH5α、工程菌，测序正确的重组菌进行扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和PAPOLB靶基因的标准品；C、PAPOLB基因甲基化的定量检测：设计并合成ACTB的探针和PAPOLB的探针：ACTB探针：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGBPAPOLB探针：FAM-ATAATCCCTAAATTATC-MGB对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR、条件是：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环；检测ACTB和PAPOLB基因的拷贝数；待检样本DNA中PAPOLB基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中PAPOLB基因甲基化程度的定量值。