KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法
本发明涉及KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者血清或肿瘤组织样本，进行基因组DNA的抽提，对KRAS基因第2号外显子进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的KRAS基因第2号外显子是否存在突变，来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性。本发明的优点是可用于癌症个体表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的应用。
发明专利
CN200910056203.1
2009-08-10
CN101654702
2010-02-24
C12Q1/68(2006.01)I
上海中优医药高科技有限公司
王 校;傅咏南
200433上海市杨浦区国泰路11号701室
上海申汇专利代理有限公司
翁若莹
上海;31
1、一种KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为：步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提步骤1被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3.基因分型：将每一个被测者样本分别放入一个反应孔，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点的基因型进行确定：步骤3-1，反应体系配置：在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；KRAS基因第2外显子正向和反向引物：正相引物：cgatggaggagtttgtaaatga反向引物：tgaaacccaaggtacatttcag步骤3-2，PCR反应条件：将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热95℃15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bp DNA标记物6ulc.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1uld.电泳电压：120ve.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；步骤3-4，纯化：终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪；步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：cgatggaggagtttgtaaatga；步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：2类结果，即正常结果和突变结果；步骤4，结果分析：(1).未检出突变：您的检测结果中未发现KRAS基因第2号外显子上存在突变；(2).检出突变：您的检测结果中发现KRAS基因第2号外显子上存在突变。