CD3^-CD56⁺NK细胞高效扩增培养系统的构建方法

摘要：

本发明的CD3^-CD56⁺NK细胞高效扩增培养系统的构建方法，主要是提供一种由Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine作为黏附剂，黏附anti-CD137 mAb和IL-15构成的体外大量扩增CD3^-CD56⁺NK细胞的培养系统，与现有的用其它方法相比，明显具有：方法简单合理，易于推广，所需原材料少，成本低，制备周期较短，扩增效率高和对肿瘤细胞的杀伤效率高等优点。实验证明，采用本发明的方法扩增的CD3^-CD56⁺NK细胞与用其他已知的细胞因子或细胞因子组合扩增的CD3^-CD56⁺NK细胞相比，在相同的细胞浓度下，对A549的杀伤能力提高一倍以上。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200810155073.2

申请日期：2008-10-31

公开/公告号：CN101386840

公开/公告日：2009-03-18

主分类号：C12N5/08(2006.01)I

申请/专利权人:江苏省人民医院

发明/设计人:束永前;居颂文

主申请人地址:210029江苏省南京市广州路300号

专利代理机构:南京众联专利代理有限公司

代理人:周新亚

国别省市代码:江苏;32

权利要求：

1. 一种CD3-CD56+NK细胞高效扩增培养系统的建立方法，其特征在于包括下述步骤：(1)取适量的黏附剂Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine用蒸馏水稀释至10％，加入塑料培养板、培养皿或培养瓶，孵育5-10min后吸掉黏附剂稀释液，使黏附剂黏附在塑料培养板、培养皿或培养瓶上；(2)取适量的anti-CD137mAb或CD137L重组蛋白和IL-15同时加入缓冲液中，稀释至浓度分别为1-10μg/ml和10-100ng/ml，将anti-CD137mAb和IL-15混合稀释液加入上述步骤(1)中制备的黏附有Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine的塑料培养板、培养皿或培养瓶中，4℃过夜，使黏附剂处理过的塑料培养板、培养皿或培养瓶上包被anti-CD137mAb和IL-15，吸去塑料板的稀释液，待用；(3)采自健康志愿者的外周血经Ficoll分离获得单个核细胞(PBMC)，用无血清培养基调整PBMC的浓度至3×106/ml，加入6孔塑料培养板培养2-3h，吸取悬浮细胞，上述悬浮细胞或从其中分选获得的高纯度NK细胞用无血清培养基调整浓度至1×106/ml，加入Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine处理过并包被anti-CD137mAb和IL-15的培养板、培养皿或培养瓶上，并同时加入IL-2，培养3-6天后，收集细胞得扩增后的CD3-CD56+NK细胞。