Exendin-4高产工程菌株的构建方法
本发明涉及基因工程领域。具体涉及Exendin-4目的基因的改造和表达载体的构建。根据Gene Bank中登录的Exendin-4的氨基酸序列，结合大肠杆菌的密码子偏嗜性，对原有基因70％的密码子进行改造，使其能在大肠杆菌中高效表达；添加合适的酶切位点和肠激酶位点，构建合适的表达载体，将重组表达载体转化入不同的大肠杆菌工程菌，筛选高效表达Exendin-4的菌株。
发明专利
CN200810049810.0
2008-05-19
CN101586104
2009-11-25
C12N15/12(2006.01)I
河南农业大学
王小纯;祖向阳;孟凡荣
450002河南省郑州市文化路95号
郑州中原专利事务所有限公司
张绍琳
河南;41
1.一种Exendin-4高产工程菌株的构建方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：(1)Exendin-4基因的改造：将Genebank中登录编号为AAB22006的Exendin-4基因改造为具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′为正向引物，以5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′为反向引物，在Exendin-4基因5′端加上限制性内切酶Kpn I位点；在Kpn I位点后添加编码肠激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识别位点的核酸序列与Exendin-4基因紧密相连；在Exendin-4基因3′端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶Nco I(CCATGG)位点；(2)克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建：利用PCR扩增的改造后的Exendin-4，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-Exendin-4；(3)高效表达载体pET-32a(+)-Exendin-4的构建：用限制性内切酶Kpn I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶Kpn I和Nco I消化表达载体质粒pET-32a(+)，回收载体pET-32a(+)大片段，将二者连接即重组Exendin-4表达载体pET-32a(+)-Exendin-4；将表达载体pET-32a(+)-Exendin-4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4高产工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4。