K-ras基因突变的定量检测方法

摘要：

本发明公开了K-ras基因突变的定量检测的方法，包括以下步骤：设计一种与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交的PNA；用所述PNA分别对已知拷贝数的突变型标准品和野生型标准品进行SYBR-RT-PCR定量检测，得出标准曲线和融解曲线；用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR-RT-PCR定量检测；根据所述融解曲线判断待测样品核酸为野生型或突变型或突变/野生混合型后，根据所述标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200710094239.X

申请日期：2007-11-15

公开/公告号：CN101434985

公开/公告日：2009-05-20

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

申请/专利权人:上海长海医院

发明/设计人:李兆申;高 军;林 寒;杜奕奇;龚燕芳

主申请人地址:200433上海市杨浦区长海路174号

专利代理机构:上海浦一知识产权代理有限公司

代理人:陈履忠

国别省市代码:上海;31

权利要求：

1. 一种K-ras基因突变的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计一种PNA，该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交，用于封闭野生型K-ras基因扩增；(2)构建突变型标准品和野生型标准品，该突变型标准品包含K-ras基因第12和/或第13密码子的突变型序列，该野生型标准品包含野生型K-ras基因序列；(3)对已知拷贝数的突变型标准品进行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于突变型K-ras基因定量的标准曲线；对已知拷贝数的野生型和/或突变型标准品进行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于总体K-ras基因定量的标准曲线；(4)由步骤(3)的SYBR—RT—PCR定量检测，得出用于定性判断待测样品为野生型或突变型或突变/野生混合型的PCR产物融解曲线；(5)在与步骤(3)相同的反应条件下，用所述PNA对待测样品核酸进行SYBR—RT—PCR定量检测，并根据步骤(4)的融解曲线的差异对待测样品核酸进行定性判断后，根据步骤(3)的标准曲线得出待测样品核酸的K-ras基因突变量及其占总体K-ras基因的比例。