一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法
本发明公开了一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，在皮肤组织块培养过程中采用自行设计的培养基能有效抑制成纤维细胞的生长，从组织块四周生长出均一的上皮样细胞，诱发表皮干细胞迁移出原来的微环境，在新生成的上皮样细胞层上重新聚集生长。这类克隆性生长的细胞与其共生的上皮样细胞有明显形态学上的差别。借助解剖镜和玻璃针就能将其挑选出来，进行单独扩增培养。对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，β<sub>1</sub>-integrin，P63，α<sub>6</sub>-integrin均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。本发明克服了传统酶消化法的缺点，直接利用干细胞的生物学行为获得纯化的表皮干细胞，可用于人类和哺乳动物表皮干细胞的分离纯化。
发明专利
CN200610041977.3
2006-03-27
CN1865436
2006-11-22
C12N5/08(2006.01)I
西北农林科技大学
杨学义;窦忠英
712100陕西省杨凌示范区渭惠路3号
西安通大专利代理有限责任公司
李郑建
陕西;61
权利要求书1.一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)首先将已脱离人或动物的皮肤，置于含青链素各500U/ml的生理盐水中带回实验室，在超净工作台上用生理盐水冲洗，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3～4块，加培养基；所述培养基的配方为：90％Medium199+10％ FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mL LIF+1～1.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；3)置于CO2培养箱中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃；，每两天换液一次；4)经3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；所述的无血清培养基的配方为：100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20ng/mL～25ng/mL)EGF+5ug/mL Insulin+(15ng/ml～20ng/mL)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；5)待细胞增殖达70～80％融合时，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，即用上述无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，或用上述无血清培养基将人类表皮干细胞传15代冻存；6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，β1-integrin，P63，α6-integrin均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。