一种快速构建基因打靶重组用载体的方法
本发明公开了一种借助于Gateway克隆系统的快速构建基因打靶重组用载体的方法。首先，它用特殊设计的PCR引物进行PCR扩增，得到用于同源重组的5’和3’同源臂，通过BP重组反应分别装入pDONRP4-P1R和pDONRP2R-P3载体中；然后，将目的片段装入我们创造性构建的中间载体pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT中；最后，将以上3种载体与pDEST R4-R3TK载体的混合物在通过1小时快速LR重组反应后，5’同源臂，中间片段，3’同源臂，以及TK负筛选元件便会自动按照设计的顺序拼接，转化并纯化后即得到基因打靶用载体。该方法具有快速、灵活、省时、省力等优点，并突破了传统方法中内切酶位点分布的限制，在基因功能研究方面有重要意义。
发明专利
CN200610037837.9
2006-01-17
CN1844401
2006-10-11
C12N15/63(2006.01)I
南京大学
孔 冬;高 翔;王鹏飞;章 念;郑 斌
210093江苏省南京市汉口路22号
南京苏高专利事务所
阙如生
江苏;32
1.一种快速构建基因打靶重组用载体的方法，其特征在于该方法的步骤为：A.5’和3’同源臂载体的构建：利用特殊设计的PCR引物，以基因组DNA为模板，用LATaq酶扩增用于同源重组的5’和3’同源臂片段，目的PCR片段通过琼脂糖凝胶分离并切胶回收后，分别与100-200ngpDONRP4-P1R或pDONRP2R-P3载体混合，在BPClonaseII酶切混合物的作用下进行Gateway同源重组反应，37℃保温1小时后转化至DH5α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养，序列的正确性用M13F、M13R引物正反测序验证，装配好的载体我们分别命名为pENTR5’和pENTR3’；B.中间载体的构建：根据不同的实验要求，对我们构建的质粒载体pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT进行改造，(1)常规基因敲除：不必做任何改造；(2)条件基因敲除或基因插入：将需要敲除或插入的片段用限制性内切酶消化，然后用T4连接酶连接至pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT载体中位于两个loxP位点之间的多克隆位点即MCS，将连接产物转化至DH5α大肠杆菌后于卡那霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养；C.最终载体的拼装：将以上3种载体与pDEST-R4R3-TK载体各60-100ng混合，加入LRClonasePlus酶切混合物进行Gateway同源重组反应，37℃保温1小时后转化至DH5α大肠杆菌后于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上进行筛选培养，对长出来的克隆进行扩增、纯化即可得到最终的重组载体。