一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆
本发明涉及一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆，属于生物技术领域。本发明的高抗紫外线细胞克隆经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，命名为Anti-UV Clone。该细胞克隆游离成原生质体后可耐受47.5J/cm<sup>2</sup>紫外线(UVA+UVB)照射。本发明具有操作简便、成本低、抗紫外线效果佳等优点。可用于细胞工程方法大规模繁殖并提取抗紫外线有效成分。
发明专利
CN200610010858.1
2006-04-27
CN1844369
2006-10-11
C12N5/04(2006.01)I
云南大学
陈穗云;夏光敏;肖春杰
650091云南省昆明市五华区翠湖北路2号
昆明正原专利代理有限责任公司
杨宏珍
云南;53
1、一株用重复筛选方法获得的高抗紫外线细胞克隆，其特征在于：(1)耐受紫外线47.5J/cm2的高抗紫外线的细胞克隆经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，具体步骤如下：a.原生质体的获得：挑取柴胡疏松的颗粒状愈伤组织，用镊子捏碎，转入添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖3％、pH5.8--6.0的MS液体培养基中震荡培养7天，在无菌条件下，将已分散的悬浮细胞再转入相同配方的液体培养基上振荡培养7天，共3--5次，然后将悬浮细胞用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5mmol/LCaCl2、1％--3％纤维素酶RS和0.3％果胶酶Y-23pH5.8的等渗混合酶液去壁处理，并在50-200rpm/min震荡1-3小时，初步过滤后用300--500rpm/min离心2-10分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选：用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5mmol/LCaCl2、pH5.8的等渗洗液清洗原生质体3-4次，将等渗洗液悬浮原生质体移入3个10cm直径的培养皿中，密度为103--107个/l，放置于超净工作台上，用38-48J/cm2紫外线照射100-130秒；照射完毕后，用添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白400--600mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖8-10％、对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸800-1000mg/L、2，4-D0.5--2mg/L、pH5.6--6.0的原生质体MS培养基置换洗液，然后盖上培养皿盖并用胶带封口，置于黑暗中，在25℃培养15-20天；随后取出形成了小细胞团的原生质体，在添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖3％、0.7％的琼脂、pH5.8--6.0的MS固体培养基上培养7天，获得3个细胞克隆；将这3个细胞克隆繁殖至每个克隆有1g鲜重时，各取少量愈伤组织细胞重新去壁，再次用48J/cm2紫外线照射130秒，得到一个正常存活原生质体，随后再生细胞壁恢复分裂，得到来源于这一个原生质体的抗紫外线细胞克隆，命名为Anti-UVClone。