TPO/FL基因转导骨髓间充质干细胞的方法

摘要：

本发明提供TPO/FL基因转导骨髓间充质干细胞的方法：(1)从人胎肝分离TPO和FL的mRNA，通过RT-PCR技术合成两种cDNA并克隆到pBluescript载体上，构建FL-IRES-TPO重组片段，再将重组片段转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；(2)对人骨髓间充质干细胞进行pfl30表达载体转导，构建高效表达外源TPO和FL的人骨髓间充质干细胞。本发明达到了一次性基因转导而获得人骨髓间充质干细胞同时高效表达TPO和FL两种外源性基因的效果；本发明方法构建的外源性表达TPO和FL的人骨髓间充质干细胞在组成造血干/祖细胞体外扩增培养体系中，降低了造血干/祖细胞体外扩增培养的成本，并同时有效提高了造血干细胞的体外自我更新、扩增和分化能力。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510050552.4

申请日期：2005-07-04

公开/公告号：CN1818071

公开/公告日：2006-08-16

主分类号：C12N15/85(2006.01)I

申请/专利权人:浙江大学%杭州大力神医疗器械有限公司

发明/设计人:王金福

主申请人地址:310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号

专利代理机构:杭州求是专利事务所有限公司

代理人:赵杭丽%张法高

国别省市代码:浙江;33

权利要求：

1.TPO/FL基因转导骨髓间充质干细胞的方法，其特征是通过以下方案实现：(1)构建pfl30表达载体从人胎肝细胞分离TPO和FL的mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应技术合成相应的cDNA，FL的cDNA片段克隆到pBluescript载体的EcoRV酶切位点上，TPO的cDNA与内核糖体进入位点序列连接形成IRES-TPO片段后再克隆到pBluescript载体中FL片段之后，构建成FL-IRES-TPO重组片段，然后，FL-IRES-TPO重组片段再从pBluescript载体通过XhoI和BamHI酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；(2)构建高效表达外源TPO和FL基因的人骨髓间充质干细胞依据LipofectAMINE转导试剂盒指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXIN重组病毒表达载体悬浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物辅助下对人骨髓间充质干细胞进行8个小时的pLXIN表达载体转导，转导细胞采用G418筛选48小时，由此构建高效表达外源TPO和FL基因的人骨髓间充质干细胞。