一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因

摘要：

本发明涉及基因定点突变的方法，具体的说是一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因，本方法分为如下步骤：片段合成；双混合；预延伸；全长DNA合成；后延伸。以来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1为起始基因验证了该方法的有效性，并获得了经稀有密码子改造的突变基因，该基因编码的SAM合成酶能在酿酒酵母中高效表达，并且能提高胞内SAM的积累量。本发明在原有重叠延伸PCR的基础上，进行了一系列重要的改进，使得在一个反应过程中实现多点定位突变。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510046414.9

申请日期：2005-05-13

公开/公告号：CN1861799

公开/公告日：2006-11-15

主分类号：C12P19/34(2006.01)I

申请/专利权人:中国科学院沈阳应用生态研究所

发明/设计人:吴文芳;安迎锋;吕安国

主申请人地址:110016辽宁省沈阳市沈河区文化路72号

专利代理机构:沈阳科苑专利商标代理有限公司

代理人:许宗富%周秀梅

国别省市代码:辽宁;21

权利要求：

权利要求书1.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于：反应过程分为以下几个步骤：(1)片段合成：以所需突变的全长基因为模板，根据突变位点的个数设计一系列平行引物，引物中包含待突变的碱基，每相邻一对引物的末端设计一个重叠区段，长度为20-30bp；采用上述每相邻的一对引物分别进行平行的PCR，实现各个DNA小片段的扩增；(2)双混合：分别纯化上述片段，分成不同组分，将等量相邻的DNA片段分别两两混合，片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成长片段，反应为无引物PCR过程；(3)预延伸：将上述多组反应后产物混合在一起，新形成的长片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成全长新模板，该步骤也是无引物PCR过程；(4)全长DNA合成：在上述反应体系中加入全长基因的一对外侧引物，以上一步产生的重组全长DNA为模板，PCR扩增出全长基因；(5)后延伸：将上述反应体系再经过10个循环的94℃变性30s，72℃退火和延伸1min。