一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和应用
本发明公开了一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和作为预防猪的由PCV2引起的相关疾病的疫苗的应用，其构建方法步骤如下：PCV2 ORF2基因的扩增、克隆；含有ORF2基因的重组穿梭载体的构建；重组腺病毒质粒载体的构建；重组腺病毒的获得。该重组腺病毒能在体内有限生长并且不断表达ORF2蛋白，使机体持续受到ORF2蛋白的刺激，不断产生针对ORF2蛋白的中和抗体，能对猪提供持久的保护力，在PCV2的防治方面具有广阔的应用前景，可以有效预防公猪的精液质量差，母猪的流产、死胎、木乃伊及产仔数少，使猪的整齐度大大提高。
发明专利
CN200510036878.1
2005-08-30
CN1769434
2006-05-10
C12N7/01(2006.01)I
广东省农业科学院兽医研究所
宋长绪;蒋智勇;王贵平;黄 忠
510640广东省广州市天河区五山
广州市华学知识产权代理有限公司
陈燕娴
广东;44
1、一种猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于步骤如下：(1)PCV2ORF2基因的扩增、克隆：提取猪肾细胞PK-15细胞中培养的PCV2的DNA作模板，扩增PCV2GD毒株ORF2基因，PCR产物用试剂盒回收与克隆载体pMD18-T进行连接；将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pMD-ORF2进行酶切、测序鉴定；(2)含有ORF2基因的重组穿梭载体的构建：用核酸限制性内切酶KpnI和核酸限制性内切酶HindIII将PCV2GD毒株ORF2基因片段切出纯化后，克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV载体的KpnI和HindIII两酶切位点间，获得含有ORF2基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF2；(3)重组腺病毒质粒载体的构建：将含有ORF2基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF2、腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用核酸限制性内切酶PmeI线性化后转化含腺病毒骨架载体Adeasier-1的BJ5183感受态细胞中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，将外源基因转入腺病毒骨架载体，经卡那霉素和酶切鉴定筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2；(4)重组腺病毒的获得：将含有外源基因的重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2用核酸限制性内切酶PacI酶切线性化后，经脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞包装成重组腺病毒rAdCMV-ORF2。