一种动物细胞高密度连续灌注培养方法

摘要：

本发明公开了一种动物细胞高密度连续灌注培养方法。其特点是通过研究细胞生长、营养物消耗和代谢副产物积累的动力学特性来研究细胞生长和营养物消耗及代谢副产物积累之间的代谢规律，确定和控制细胞生长的最佳营养环境，通过化学计量关系和灌注培养策略满足细胞生长所需的营养物质量。从而解决了营养物耗竭和副产物积累之间的矛盾。采用本发明所形成的工艺可将各种营养物控制在一个较低的合适浓度，既可保证细胞的营养供应，不会限制细胞的生长，又可降低有毒废物的产生，从而可获得高的细胞密度和产物浓度。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510030199.3

申请日期：2005-09-29

公开/公告号：CN1778903

公开/公告日：2006-05-31

主分类号：C12N5/06(2006.01)I

申请/专利权人:华东理工大学

发明/设计人:谭文松;朱明龙;牛红星;周 燕;华 平;顾小华

主申请人地址:200237上海市梅陇路130号

专利代理机构:中原信达知识产权代理有限责任公司

代理人:罗大忱

国别省市代码:上海;31

权利要求：

1.一种动物细胞高密度连续灌注培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)目标细胞株在初始培养基中进行批培养；(2)计算培养过程中的细胞生长、培养基中各种营养物消耗和代谢副产物生成以及目标产物生成等动力学参数；(3)根据计算结果重新设计灌注培养过程中的初始培养基和灌注培养基的营养物组成，并进行灌注培养；重复(3)～(4)步骤对计算结果进行迭代优化，并根据培养过程所需达到的细胞密度和生产能力设定培养基连续灌注的速率，以获得高的细胞密度和目标产物浓度。动力学方程及计算批培养参数计算动力学方程细胞：<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mfrac> <msub> <mi>dX</mi> <mi>V</mi> </msub> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mi>&mu;</mi> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mrow></math>]]></math-cwu>或<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mi>&mu;</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mn>1</mn> <mrow> <msub> <mi>t</mi> <mn>2</mn> </msub> <mo>-</mo> <msub> <mi>t</mi> <mn>1</mn> </msub> </mrow> </mfrac> <mi>ln</mi> <mfrac> <msub> <mi>X</mi> <mrow> <mi>V</mi> <mn>2</mn> </mrow> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mrow> <mi>V</mi> <mn>1</mn> </mrow> </msub> </mfrac> </mrow></math>]]></math-cwu>(计算细胞的比生长速率)营养物：<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mfrac> <mi>dS</mi> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mo>-</mo> <msub> <mi>q</mi> <mi>S</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mrow></math>]]></math-cwu>或<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <msub> <mi>q</mi> <mi>S</mi> </msub> <mo>=</mo> <mo>-</mo> <mfrac> <mn>1</mn> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mfrac> <mfrac> <mi>dS</mi> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mo>-</mo> <mi>&mu;</mi> <mfrac> <mi>dS</mi> <mrow> <mi>d</mi> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mrow> </mfrac> </mrow></math>]]></math-cwu>(计算营养物的比消耗速率)产物：<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mfrac> <mi>dP</mi> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <msub> <mi>q</mi> <mi>P</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mrow></math>]]></math-cwu>或<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <msub> <mi>q</mi> <mi>P</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mn>1</mn> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mfrac> <mfrac> <mi>dP</mi> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mi>&mu;</mi> <mfrac> <mi>dP</mi> <mrow> <mi>d</mi> <msub> <mi>X</mi> <mi>V</mi> </msub> </mrow> </mfrac> </mrow></math>]]></math-cwu>(计算细胞产生代谢副产物的比生成速率)产物浓度：P＝qP∫Xvdt灌注培养参数计算动力学方程物料进出速率相等，大部分细胞截留在反应器中，总稀释率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，细胞流出率Db＝Fb/V。细胞：<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mfrac> <msub> <mi>dX</mi> <mi>v</mi> </msub> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mi>&mu;</mi> <mo>-</mo> <msub> <mi>k</mi> <mi>d</mi> </msub> <mo>-</mo> <msub> <mi>D</mi> <mi>b</mi> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> <mo>;</mo> <mfrac> <mrow> <mi>d</mi> <msub> <mi>X</mi> <mi>d</mi> </msub> </mrow> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <msub> <mi>k</mi> <mi>d</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> <mo>-</mo> <msub> <mi>D</mi> <mi>b</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>d</mi> </msub> </mrow></math>]]></math-cwu>营养物：<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mfrac> <mi>dS</mi> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <mi>D</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msub> <mi>S</mi> <mi>f</mi> </msub> <mo>-</mo> <mi>S</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>-</mo> <msub> <mi>q</mi> <mi>s</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> </mrow></math>]]></math-cwu>产物：<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mfrac> <mi>dP</mi> <mi>dt</mi> </mfrac> <mo>=</mo> <msub> <mi>q</mi> <mi>P</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> <mo>-</mo> <mi>DP</mi> </mrow></math>]]></math-cwu>在稳定状态下，<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mi>&mu;</mi> <mo>=</mo> <msub> <mi>k</mi> <mi>d</mi> </msub> <mo>+</mo> <msub> <mi>D</mi> <mi>b</mi> </msub> <mo>,</mo> <msub> <mi>q</mi> <mi>s</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>D</mi> <mrow> <mo>(</mo> <msub> <mi>S</mi> <mi>f</mi> </msub> <mo>-</mo> <mi>S</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> </mfrac> <mo>,</mo> <msub> <mi>q</mi> <mi>P</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mi>DP</mi> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> </mfrac> <mo>.</mo> </mrow></math>]]></math-cwu>其中目标产物浓度可表示为<math-cwu><![CDATA[<math> <mrow> <mi>P</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <msub> <mi>q</mi> <mi>P</mi> </msub> <msub> <mi>X</mi> <mi>v</mi> </msub> </mrow> <mi>D</mi> </mfrac> </mrow></math>]]></math-cwu>符号说明：Xv活细胞密度(106cells/mL)Xt总细胞密度(106cells/mL)Viability细胞活性(％)μ细胞比生长速率(day-1)D灌注速率或称稀释率(day-1)F流加速率(mL/day)Gluc，Gln底物浓度(mM)Lac，Amm副产物浓度(mM)MAb单抗浓度(mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副产物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb单抗比生产速率(mg/109cells/day)Yx/GlucYx/Gln单位底物消耗的细胞产率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln单位营养物消耗的副产物产率(mmol/mmol)V培养体积(mL)。