一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其应用

摘要：

一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其在核酸检测中的应用。反应液含内套引物和外套引物，内套引物与目标基因顺序有错配或在5’端带一段非基因专一顺序。内套引物与原始模板的最高允许退火温度低于第一轮反应的退火温度，而内套引物与匹配模板的解链温度高于外套引物的最高允许退火温度。控制第一轮PCR循环的退火温度使外套引物能退火扩增但内套引物不能退火扩增。提高第二轮PCR循环的退火温度使外套停止退火扩增而内套引物能退火扩增。在第一和第二轮之间有二至若干循环退火温度低于二者的过渡阶段，使内套引物能与原始模板退火扩增形成匹配模板启动第二轮反应。整个PCR反应过程中不开管盖反应管也不移离基因扩增仪。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510025634.3

申请日期：2005-04-30

公开/公告号：CN1858219

公开/公告日：2006-11-08

主分类号：C12P19/34(2006.01)I

申请/专利权人:徐定邦%徐文慧

发明/设计人:徐定邦;谢文凯;府雷宇

主申请人地址:200071上海市永兴路58弄2号603室

国别省市代码:上海;31

权利要求：

权利要求书1，一种以基因组DNA或cDNA为模板的单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法，反应液含至少一对外套引物和至少一个内套引物，内套引物顺序与原始目标模板顺序有错配或在5’端有一段非基因专一顺序。PCR反应依次包括如下步骤：(1)DNA模板变性解链；(2)引物与模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；按退火温度擴增分为二輪反應，其特征在于二輪反應之間不打開反應管蓋並保持原位。第二轮内套反应的退火温度高于第一轮外套反应的退火温度，二轮反应之间的过渡循环的退火温度比二轮反应都低。