一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法
本发明公开了一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法。该方法包括微生物菌株的培养、以微生物的完整细胞作为生物催化剂，以尼古丁为底物生物转化合成6-羟基-3-琥珀酰-吡啶以及用沉淀的方法分离纯化6-羟基-3-琥珀酰-吡啶等步骤。本发明的方法具有操作简单，容易控制，转化条件要求宽泛，产物分离纯化简单等特点。为生物转化法大规模生产6-羟基-3-琥珀酰-吡啶提供了可能。
发明专利
CN200510025598.0
2005-04-29
CN1854302
2006-11-01
C12P17/12(2006.01)I
上海爱普香料有限公司
许 平;王书宁;马翠卿;唐鸿志;杜 毅
201809上海市嘉定曹新路33号
上海市华诚律师事务所
李 平
上海;31
权利要求书1、一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，由如下步骤组成：(1)微生物菌种：选择恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假单胞菌(Pseudomonas sp.)DSM8653、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244和假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922之一；(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有质量体积比为0.2～5％的尼古丁的固体斜面基本培养基上，25℃～37℃培养12～24小时；(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.2～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～24小时，制得一级种子；(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，接一级种子于200～1000mL含有质量体积比为0.2～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～24小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养：以5％的体积比的接种量，接二级种子于2～20L含有质量体积比为0.5～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的光密度达到0.6～3.7，终止发酵培养；(6)收集细胞：取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10～15分钟，收集发酵培养的细胞，并用pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集细胞沉淀，此细胞沉淀即为生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)转化反应：将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于蒸馏水中，再加入尼古丁，混匀，使混合物中生物催化剂的终浓度为620nm下1～10个光密度，尼古丁的终浓度为1～7g/L；调pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350转/分钟条件下振荡，使生物催化剂、尼古丁与空气充分混合；反应期间取样，用HPLC检测6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成情况，当反应混合物中6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成量达到0.6g/L～4.7g/L时，终止转化反应；(8)生物催化剂的去除：将步骤(7)终止反应后的反应混合物，以6,000～12,000转/分10～30分钟离心，去除步骤(7)中所加入的生物催化剂，得到含有6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；(9)浓缩：将步骤(8)制得的上清液，在真空度0.08～0.1MPa，50℃～70℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/20～1/5；(10)6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集：将步骤(9)制得的浓缩液以盐酸溶液调pH为2～3.5，然后在4℃下静置2～5小时，使6-羟基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；将得到的沉淀用抽滤的方法去除上清溶液，再用体积比为3～6倍的盐酸溶液洗涤；然后将所得的沉淀在40℃～60℃，真空度为0.08～0.1MPa的条件下，干燥2～8小时，最后得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶；(11)样品检测：将步骤(10)制得的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC、ESI-MS、13C NMR和1H NMR检测纯度和结构。