pET15b-PEP-1-Cat质粒及构建、PEP-1-CAT融合蛋白及表达

摘要：

本发明提出了可以以天然活性形式穿透细胞的pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达纯化方法。具体如下：设计并合成两端分别带Sal I和Bgl II酶切位点的Cat引物，用PCR方法以pZeoSV2(+)-Cat质粒为模板，特异性扩增Cat全长cDNA；将扩增的Cat cDNA与dATP反应，利用Taq DNA聚合酶在CAT cDNA的3’末端加“A”并纯化，然后应用TA克隆将Cat cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中得到pGEM-T-Cat；人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸，两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点，将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切，将回收得到的Cat cDNA片段与pET15b-PEP-1相连，构建出质粒pET15b-PEP-1-Cat。融合蛋白的表达纯化如下：用质粒pET15b-PEP-1-Cat转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌，然后在培养基中发酵；发酵结束，用冰浴超声破菌，收集超离后的上清液，用Ni²⁺-NTA-琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白，把纯化的融合蛋白充分脱盐，把纯化的融合蛋白过除菌后，用Eppendorf管分装，-80°C保存。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510019900.1

申请日期：2005-11-24

公开/公告号：CN1974774

公开/公告日：2007-06-06

主分类号：C12N15/63(2006.01)I

申请/专利权人:王家宁

发明/设计人:王家宁

主申请人地址:442000湖北省十堰市朝阳中路23号十堰市人民医院临床医学研究所

专利代理机构:十堰博迪专利事务所

代理人:张秀英

国别省市代码:湖北;42

权利要求：

权利要求书1、pET15b-PEP-1-Cat质粒，采用pET15b为表达载体，PEP-1-Cat基因见序列表中的核苷酸序列。