一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法
本发明公开了一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法，首先是设计引物，所提供的套式聚合酶链式反应包括二次PCR，4对引物，变形链球菌两对正反引物和茸毛链球菌两对正反引物；其次是细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取；第三是第一次PCR，依次加入两对引物，四种dNTP混合物及模板DNA和Taq酶；第四是第二次PCR，将第一次PCR产物稀释，加入另外两对引物，进行扩增；第五是电泳。本发明方法简单，成本低廉。
发明专利
CN200510019132.X
2005-07-21
CN1737161
2006-02-22
C12Q1/68(2006.01)I
武汉大学
边 专;谭海平;孟柳燕;樊明文
430072湖北省武汉市武昌珞珈山
武汉宇晨专利事务所
王敏锋
湖北;42
1、一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法，它包括下列步骤：A、设计引物：所提供的套式聚合酶链式反应包括二次PCR，变形链球菌第一对正反引物为5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二对正反引物为5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛链球菌第一对正反引物为5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二对正反引物为5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC；B、细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取：首先是细菌DNA的提取：3ml细菌隔夜培养物，10000rpm离心，4℃10分钟，去上清，200μlTE缓冲液冲洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃30分钟，加40μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl，混匀，37℃3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，无水乙醇沉淀DNA，离心10000rpm10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中；其次是唾液染色体DNA的提取：1ml唾液，8000rpm，4℃离心15分钟，去上清，500μlTE缓冲液洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃30分钟，加4μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl，混匀，37℃3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，乙醇沉淀DNA，离心1,0000rpm，10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中；C、第一次PCR：依次加入两对外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4种dNTP混合物4μl，10×反应缓冲液5μl，细菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，灭菌水36μl，混匀，反应按94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃延伸5分钟；D、第二次PCR：将第一次PCR产物取2μl，稀释10倍后，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其步骤同第一次PCR；E：电泳：取扩增产物5μl，1.0％琼脂糖凝胶电泳电压80V，0.5μg/ml溴化已锭染色，以DL2,000DNAMarker为标准对照，在紫外检测仪下观察扩增带。