一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法
本发明公开了一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，所述谷氨酰胺转胺酶由序列表SEQ IDNo1所示的核苷酸序列所编码的序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列，一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：(1)根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET-MTG，并转化大肠杆菌成为工程菌；(2)重组MTG包涵体的纯化和复性，即得到一种由序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。
发明专利
CN200510014476.1
2005-07-13
CN1769437
2006-05-10
C12N9/10(2006.01)I
天津昂赛细胞基因工程有限公司
韩忠朝;徐 斌;杨 萍;孟 磊
300457天津市天津经济技术开发区第四大街80号
天津市北洋有限责任专利代理事务所
陆 艺
天津;12
1.一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQIDNo3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQIDNo4所示，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，所述谷氨酰胺转胺酶的基因片段由序列表SEQIDNo1所示，通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET-MTG，并转化大肠杆菌成为工程菌；(2)重组MTG包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，经超声破菌后离心取沉淀，再经过洗涤获得MTG包涵体；将纯化的包涵体溶于20mol、pH＝8.0Tris-HCl中，使包涵体蛋白浓度为18～22mg/ml，所述Tris-HCl中含8mol/L尿素，20mmol/L二硫苏糖醇和1mmol/L乙二铵四乙酸二钠，室温搅拌1～3小时，离心去除沉淀后，用HCl调pH至3～5，再次离心去除沉淀，用20mmol、pH4.0的乙酸缓冲液稀释50倍，4℃搅拌放置5～15h，用NaOH水溶液调pH至6.0～7.0，离心去除沉淀后，用10倍体积的20mmol、pH＝6.0磷酸缓冲液，透析二次，复性产物，上SP-琼脂糖凝胶柱，用pH＝6.0磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用0.5mol/LNaCl水溶液洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，冻干，即得到一种由序列表SEQIDNo2所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。