一种RNA逆转录扩增标记探针的制备方法

摘要：

本发明提供了一种在基因芯片的制备中能用少量的mRNA为模板，扩增出大量cDNA探针的标记方法。采用一步逆转录法，只需用一种逆转录酶反应，只用了一种引物，使操作更简单、成本大大降低、步骤少而节约时间。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN00114998.9

申请日期：2000-03-20

公开/公告号：CN1314467

公开/公告日：2001-09-26

主分类号：C12N15/10

申请/专利权人:上海博道基因开发有限公司

发明/设计人:毛裕民;谢毅;李瑶

主申请人地址:200092上海市中山北二路1111号3号楼12层

国别省市代码:上海;31

权利要求：

权利要求书1、一种RNA逆转录扩增标记探针的制备方法，其特征在于，应用循环逆转录方法，(1)CRT(循环逆转录)反应体系(50μl)为：在反应体系中加入1x反应液，Tris-HCl pH7.5-8.5,10-50mmol/l；(NH4)2SO45.0-25mmol/l；MnCl2 1.0-5.0mmol/l；DTT 0.5-5.0mmol/l；dNTP 0.05-1mmol/L；Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)0.04-0.2mmol/L；polydT18 0.5-2.0umol/l；耐热逆转录酶0.8-8U；mRNA模板50ng-300ng。(2)循环逆转录(CRT)，即变性-复性-延伸的循环过程，其于PCR仪中的程序和条件为：变性：温度条件：85-94℃，保温时间：5-120秒；复性：温度条件：45-60℃，保温时间：5-100秒；延伸：温度条件：55-70℃，保温时间：5-300秒。循环次数：10-40个然后进行纯化去掉未掺入的单核苷酸。